Trang Chính
1. Giới thiệu
Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm (Gram dương và Gram âm) dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào.
Nhuộm Gram được thực hiện trên dịch cơ thể hoặc mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn. Nó cho kết quả nhanh hơn cấy, và có ý nghĩa đặc biệt quan trọng giúp phân biệt bệnh do nhiễm khuẩn với các trường hợp không do nhiễm khuẩn vì điều trị và tiên lượng sẽ khác nhau.
2. Chuẩn bị
Vật liệu, hoá chất
- Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet)
- Dung dịch Iod (dung dịch Lugol)
- Dung dịch tẩy màu: Etanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml etanol 95% với 30ml aceton.
- Dung dịch nhuộm bổsung: Safranin hay Fuchsin Ziehl
Bệnh phẩm
- Dịch tiết từ vết thương, sang thương: không được rửa trước
- Bệnh phẩm có thể được bác sĩ, điều dưỡng lấy sẵn để vào một ống nghiệp vô trùng, phải bảo đảm không nhiễm khuẩn.
3. Các bước tiến hành
- Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít bệnh phẩm hòa vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.
- Cố định tiêu bản vi khuẩn: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
- Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước tối đa 5 giây, thấm khô.
- Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
- Để nghiêng phiến kính 45o, tẩy màu bằng dung dịch alcohol 95% cho đến khi giọt cuối cùng chảy ra khỏi phiến kính không còn màu (thông thường khoảng 10 –30 giây) thì rửa nước, thấm khô. Đây là bước quan trọng nhất.
- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 1-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí
- Soi kính: Sử dụng dầu soi kính và vật kính dầu để quan sát
4. Kết quả:
- Nhóm Gram dương có đặc tính không bị dung môi hữu cơEtanol, Aceton tẩy phức chất màu giữa tím kết tinh và Iot. Kết quả là màu tím
- Nhóm Gram âm bị dung môi hữu cơ tẩy màu thuốc nhuộm ban đầu do đó sẽ bắt màu với thuốc nhuộm bổ sung (đỏ vàng với Safranin, đỏ tía với Fuchsin).
5. Giải thích tính bắt màu Gram của vi khuẩn
Sự bắt màu Gram khác nhau ở vi khuẩn Gram dương và Gram âm là do tính thẩm thấu khác nhau đối với ethanol của hai nhóm vi khuẩn đó. Nếu dùng lysozyme biến đổi vi khuẩn Gram dương thành protoplast không có vách thì protoplast lại bắt màu Gram âm.
Sơ đồ minh họa thành tế bào vi khuẩn Gram dương (trái) và Gram âm (phải)
Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dày từ 15 đến 50 nm, dạng lưới, cấu tạo bởi peptidoglycan. Chất này có khả năng giữ phức hợp tím kết tinh - lugol. Trong khi đó, lớp thành tế bào peptidoglycan của các vi khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thường có thêm lớp màng lipopolysaccharde (LPS) bên ngoài.
Sau khi nhuộm với phức hợp tím kết tinh - lugol, mẫu được xử lí tiếp với hỗn hợp khử màu, làm mất nước của các lớp peptidoglycan trong thành tế bào Gram dương, từ đó làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến thành tế bào bắt giữ phức hợp tím kết tinh – lugol bên trong tế bào.
Đối với vi khuẩn Gram âm, hỗn hợp khử màu đóng vai trò là chất hoà tan lipit và làm tan màng ngoài của thành tế bào. Lớp peptidoglycan mỏng (chỉ khoảng 10 nm) không thể giữ lại phức hợp tím kết tinh – lugol và tế bào Gram âm bị khử màu và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung.
Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm (Gram dương và Gram âm) dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào.
Nhuộm Gram được thực hiện trên dịch cơ thể hoặc mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn. Nó cho kết quả nhanh hơn cấy, và có ý nghĩa đặc biệt quan trọng giúp phân biệt bệnh do nhiễm khuẩn với các trường hợp không do nhiễm khuẩn vì điều trị và tiên lượng sẽ khác nhau.
2. Chuẩn bị
Vật liệu, hoá chất
- Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet)
- Dung dịch Iod (dung dịch Lugol)
- Dung dịch tẩy màu: Etanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml etanol 95% với 30ml aceton.
- Dung dịch nhuộm bổsung: Safranin hay Fuchsin Ziehl
Bệnh phẩm
- Dịch tiết từ vết thương, sang thương: không được rửa trước
- Bệnh phẩm có thể được bác sĩ, điều dưỡng lấy sẵn để vào một ống nghiệp vô trùng, phải bảo đảm không nhiễm khuẩn.
3. Các bước tiến hành
- Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít bệnh phẩm hòa vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.
- Cố định tiêu bản vi khuẩn: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
- Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước tối đa 5 giây, thấm khô.
- Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
- Để nghiêng phiến kính 45o, tẩy màu bằng dung dịch alcohol 95% cho đến khi giọt cuối cùng chảy ra khỏi phiến kính không còn màu (thông thường khoảng 10 –30 giây) thì rửa nước, thấm khô. Đây là bước quan trọng nhất.
- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 1-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí
- Soi kính: Sử dụng dầu soi kính và vật kính dầu để quan sát
4. Kết quả:
- Nhóm Gram dương có đặc tính không bị dung môi hữu cơEtanol, Aceton tẩy phức chất màu giữa tím kết tinh và Iot. Kết quả là màu tím
- Nhóm Gram âm bị dung môi hữu cơ tẩy màu thuốc nhuộm ban đầu do đó sẽ bắt màu với thuốc nhuộm bổ sung (đỏ vàng với Safranin, đỏ tía với Fuchsin).
5. Giải thích tính bắt màu Gram của vi khuẩn
Sự bắt màu Gram khác nhau ở vi khuẩn Gram dương và Gram âm là do tính thẩm thấu khác nhau đối với ethanol của hai nhóm vi khuẩn đó. Nếu dùng lysozyme biến đổi vi khuẩn Gram dương thành protoplast không có vách thì protoplast lại bắt màu Gram âm.
Sơ đồ minh họa thành tế bào vi khuẩn Gram dương (trái) và Gram âm (phải)
Vi khuẩn Gram dương có thành tế bào dày từ 15 đến 50 nm, dạng lưới, cấu tạo bởi peptidoglycan. Chất này có khả năng giữ phức hợp tím kết tinh - lugol. Trong khi đó, lớp thành tế bào peptidoglycan của các vi khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thường có thêm lớp màng lipopolysaccharde (LPS) bên ngoài.
Sau khi nhuộm với phức hợp tím kết tinh - lugol, mẫu được xử lí tiếp với hỗn hợp khử màu, làm mất nước của các lớp peptidoglycan trong thành tế bào Gram dương, từ đó làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến thành tế bào bắt giữ phức hợp tím kết tinh – lugol bên trong tế bào.
Đối với vi khuẩn Gram âm, hỗn hợp khử màu đóng vai trò là chất hoà tan lipit và làm tan màng ngoài của thành tế bào. Lớp peptidoglycan mỏng (chỉ khoảng 10 nm) không thể giữ lại phức hợp tím kết tinh – lugol và tế bào Gram âm bị khử màu và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung.